earticle

영어

The protein-bound innerpolysaccharides (IPS) produced by suspended mycelial cultures of Inonotus obliquus have promising potentials as an effective antidiabetic as well as an immunostimulating agents. To enhance IPS production, intensive strain improvement process should be carried out using large amount of UV-mutated protoplasts. During the whole strain-screening process, the stage of solid growth-culture was found to be the most time-requiring step, thus preventing rapid screening of high-yielding producers. In order to reduce the cell growth period in the solid growth-stage, therefore, solid growth-medium was optimized using the statistical methods such as (i) Plackett-Burman and fractional factorial designs (FFD) for selecting positive medium components, and (ii) steepest ascent (SAM) and response surface (RSM) methods for determining optimum concentrations of the selected components. By adopting the medium composition recommended by the SAM experiment, significantly higher growth rate was obtained in the solid growth-cultures, as represented by about 41% larger diameter of the cell growth circle and higher mycelial density. Sequential optimization process performed using the RSM experiments finally recommended the medium composition as follows: glucose 25.61g/L, brown rice 12.53 g/L, soytone peptone 12.53 g/L, MgSO4 5.53 g/L, and agar 20 g/L. It should be noted that this composition was almost similar to the medium combinations determined by the SAM experiment, demonstrating that the SAM was very helpful in finding out the final optimum concentrations. Through the use of this optimized medium, the period for the solid growth-culture could be successfully reduced to about 8 days from the previous 15~20 days, thus enabling large and mass screening of high producers in a relatively short period.

한국어

광범위한 약리작용을 가지고 있어 질병의 치료 및 예방 에 효과가 있는 천연물 중 가장 주목받고 있는 약용버섯은 분류학상 균류 (Fungi) 중 진균류 (Eumycetes)에 속하며 대부분은 담자균류 (Basidiomycetes)의 일종이다 [1,2]. 최근 담자균류 유래 약용버섯들의 항암효과가 과학적으로 입증 되고 있으며 [3,4], 약용버섯 추출물 중에서 특별히 면역증 강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이 는 생리활성물질은 β-D-glucan 구조를 갖는 수용성 단백다 당체 (향후 “단백다당체”로 명명함)로 구성되어 있음이 밝 혀졌다 [5,6,7,8]. 표고버 섯균사체 추출물의 경우 면역증 강효과로 인해 기능성 식품과 암치료 (보조)제 의약품으로 사용되고 있다. 이 버섯의 자실체에서 추출한 단백다당체 역시 항암성 면역증강제인 Lentinan 주사제로 판매되고 있 다. 이 외에도 액상배양된 운지버섯 균사체에서 추출한 단백 다당체 (PSK 및 Krestin)는 항암성 면역증강제로, 치마버섯 균사체 배양시 생합성되는 세포외다당체 (exopolysaccharides) 역시 동일한 효능의 주사제 (Shizophyllan)로 판매되고 있다. 학명이 Inonotus obliquus로 불리는 차가 (Chaga, Tchaga) 버섯은, 나무줄기나 그루터기에 자생하는 백색부후균의 일종 으로, 1년에 0.9 cm 이하로 자라는 매우 귀한 약용버섯이다. Inonotus obliquus 유래의 대표적인 생리활성물질인 단백다 당체의 경우 항당뇨 효과 [9] 및 면역증강 효과로 인한 항암 효과가 뛰어난 것으로 이미 오래 전에 입증된 바 있는데 [10,11,12], 이러한 단백다당체는 특별히 고안된 정제과정을 거쳐 정제될 경우 건조중량의 5% 이하의 함량을 나타내는 미량성분이다 [13,14]. Inonotus obliquus는 최소 5년 이상 성장해야 포자가 형성되고, 통상 10~20년 이상 자라야 채집 이 가능한 것으로 알려져 있다. 이처럼 차가버섯 자실체의 까다로운 성장조건으로 인해 생산성이 매우 낮으므로, 정품 의 야생 차가버섯을 구입하기가 쉽지 않고, 그 가격 또한 매 우 비싼 실정이다. 한편 차가버섯 자실체의 고체배양에 의해 단백다당체를 생산하는 방법은 대량생산 시 품질관리가 힘 들며 자실체 재배를 위한 많은 노동력과 시간이 요구됨에 따라 생산성도 떨어지는 단점이 있다 [15,16]. 반면에 차가버섯 균사체 액상배양을 통한 단백다당체 생산공정은 기존의 자실체 배양을 통해 생산하는 방법에 비 해 보다 잘 규명된 조건하에서 대량 생산이 가능하며 배양 기간 또한 단축시켜 생산성을 크게 높일 수 있는 장점이 있다 [17,18,19]. Inonotus obliquus 균사체의 액상배양에 의한 단백다당체의 산업적인 대량생산을 위해서는 고생산성 균주의 확보가 핵심적인 관건이다. 고생산성 균주를 개발 하기 위해서는 최종 생산배양에서 선별된 균주들의 단백다 당체 생산성을 확인해야 하는데, 이를 위해서는 다음의 일련 의 배양공정을 거쳐야 한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형 질체 형성 및 재생, 고체성장배지에서의 계대배양 (고체성 장배장), 정치배양, 플라스크에서의 액상 성장배양을 거쳐 최종적으로 플라스크 또는 발효조애서의 액상 생산배양. 이 일련의 배양공정에서 균주개발 시 가장 큰 장애요인은 고체 성장배지에서의 계대배양 (이후 “고체성장배양”)인데. 그 이유는 이 배양 단계에서 특별히 장기간의 배양 시간이 요구 되어 신속한 균주개발이 매우 어렵기 때문이다. 본 연구에 서는 고체성장배양 시의 이러한 문제점을 극복하고자, 배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 본 연구팀은 실제로 원형질체 형성을 통한 균주 개량에 관한 연구를 통해, 고체성장배양에서 훌륭한 성장 특성을 보이 는 균주들이 최종 액상 생산배양에서도 단백다당체의 생산 성이 높음을 확인한 바 있다 [20]. Inonotus obliquus 균사체와 같은 균사형성 고등균류의 경우 배지성분에 따라 배양 생리적 및 배양 형태적 특성이 확연히 달라진다. 따라서 고생산성 균주의 신속 선별을 위 해서는 고체성장배지에 포함되는 영양원의 성분 및 조성의 최적화가 필수적이다. 배지 최적화를 수행할 때 단일 요소 에 대해서만 변화를 줄 경우, 영양원 간의 상호작용을 제 대로 파악할 수 없으므로 최적 배지조성을 찾기 힘들며, 여러 요소를 전체적으로 조사할 경우 과다한 실험양으로 인한 한계에 직면하게 된다. 이러한 어려움을 해결하기 위 해 본 연구에서는 유용대사산물의 생물공학적 대량생산을 위해 주로 사용되는 통계적 배지최적화 방법을 도입하였다 [21,22,23]. 즉 고체성장배지의 조성을 최적화하기 위해 균 체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 주요 배지성분들을 우 선 찾아내고, 그 성분들의 교호작용을 확인하기 위한 다양 한 통계적 실험방법들을 순차적으로 적용한 후, 최종적으 로 반응표면분석법을 적용하여 균사체의 성장속도가 최대 가 되는 배지조성을 결정하였다.