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영어

Purpose: This study was designed to determine whether a novel anti-melanogenic agent, PF3758309, has the potential to cause acute cutaneous irritation using a human skin equivalent model (HSEM). Methods: Human skin equivalent was constructed through incubation of normal human derived epidermal keratinocytes (HEKs) on collagen matrix insert with proliferation media. Using constructed human skin equivalent, the irritation potential of PF3758309 were investigated whether the viability of this agent-treated HESM is under 50% (irritant) or not (non-irritant) using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after applying the agent to the epidermal surface of the HSEM. Also, the PF3758309- mediated anti-pigmentation effects were analyzed using Fontana-Masson staining in the HSEM. Results: The integrity of the constructed HSEM was confirmed using immunohistochemical staining with differentiation markers of epidermis, and observed that Keratin 5, Keratin 1 and Involucrin were stained in basal, supra-basal and granular layers, respectively. In vitro irritation assay showed that the mean viabilities of the PF3758309 was 83.6%, 78.8% and 77.8% at the treatment doses of 0.2, 0.5 and 1 mg, respectively; however, the mean viability of the positive control (5% sodium dodecyl sulfate)-treated HESM was 2.8%. Also, in vitro corrosion assay showed that the mean viabilities of the PF3758309 was 95.3%, 95.0% and 94.2% at the treatment doses of 0.2, 0.5 and 1 mg, respectively. Furthermore, using a Fontana-Masson staining assay, the melanin levels in the PF3758309-treated HSEM was significantly decreased compared with the levels in control HSEM. Conclusion: The anti-melanogenic agent, PF3758309, has no skin irritation potential under the conditions used in this study.

한국어

목적: 본 연구는 인간피부유사모델(human skin equivalent model, HSEM)을 사용하여 멜라닌 합성저해제로 알려진 PF3758309 의 피부 자극성을 동물대체시험법의 일환으로 평가하고자 하였다. 방법: 인체피부유사체는 콜라겐으로 코팅된 matrix insert 위 에 인간에서 분리한 각질세포(human epidermal keratinocyte, HEK)를 성장 배지와 함께 배양시켜 제작하였다. 제작된 인간피부 유사모델을 사용하여 PF3758309의 피부 자극성(irritation)에 대해서 평가하고자, 해당 물질을 HSEM의 각질 표면 위에 처리한 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 통하여 세포생존율을 측정하였다. 세포생존율이 50% 이하일 경우 자극성이 존재하며, 50% 이상일 경우 비자극성으로 판단할 수 있다. 또한, HSEM을 이용하여 PF3758309의 피부 부 식성(corrosion) 및 멜라닌 합성 저해능을 검증하였다. 결과: 제작된 HSEM의 integrity는 epidermal differentiation markers인 Keratin 5, Keratin 1, Involucrin의 발현을 면역조직화학염색법으로 검증하였다. HSEM에 PF3758309를 15 min 동안 처리 후, in vitro irritation assay를 진행한 결과, PF3758309의 처리 농도가 0.2, 0.5, 1.0 mg 일 때, 세포생존율은 각각 83.6%, 78.8%, 77.8% 로 나타났으며, 양성대조군인 5% sodium dodecyl sulfate을 처리시 세포생존율 2.8%를 나타내었다. 또한, in vitro corrosion assay 를 진행한 결과, PF3758309의 처리 농도가 0.2, 0.5, 1.0 mg 일 때, 세포생존율은 각각 95.3%, 95.0%, 94.2%로 나타났다. 뿐만 아 니라, Fontana-Masson 염색법을 활용하여 PF3758309가 처리된 HSEM의 멜라닌 수준은 대조군 대비 현저하게 감소됨을 보였다. 결론: 멜라닌 합성 저해제로 알려진 PF3758309는 피부자극성이 없음을 본 실험을 통해 나타내었다.

중국어

目的: PF375830是一种被称为黑色素合成抑制剂。本研究利用人体皮肤等效模型（human skin equivalent model, HSEM）评估PF3758309的皮肤刺激作为替代动物试验方法。方法: 通过将正常人源性表皮角质形成 细胞（human epidermal keratinocyte, HEK）与增殖培养基一起孵育在胶原基质插入物上来构建人体皮 肤等效物。使用构建的人体皮肤等效物，研究PF3758309的刺激可能性，将该试剂施用于表皮表面后，通过 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)试验测定细胞存活率。若细胞存活 率低于50％，则有刺激性；若细胞存活率高于50％，则可判断为无刺激性。此外，HSEM用于验证皮肤腐蚀 和抑制PF3758309的黑色素合成。结果: 利用免疫组织化学染色法，通过表皮分化标志物角蛋白5，角蛋白1 和Involucrin的表达验证了制作的HSEM的完整性。在HSEM中，用PF3758309处理15 min之后，测定体外 刺激试验结果显示: 当PF3758309分别以0.2，0.5和1.0 mg浓度处理时，细胞存活率分别为83.6％，78.8％和 77.8％，而阳性对照组（5％十二烷基硫酸钠）的细胞存活率为2.8％。体外腐蚀实验表明，当PF3758309的 处理浓度分别为0.2，0.5和1.0 mg时，细胞存活率分别为95.3％，95.0％和94.2％。此外，与对照相比，使用 Fontana-Masson染色方法观察到用PF3758309处理的HSEM的黑色素水平显着降低。结论: 通过以上研究，抗 黑素生成剂PF3758309不具有皮肤刺激性。