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형질전환동물 유래 재조합 혈액응고 제8인자 정제를 위한 전처리방법개선 및 크로마토그래피 분리정제

초록

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A형 혈우병은 혈액응고 제 8인자(FactorVIII: FVIII)가 유전적으로 결핍되어 나타나는 희귀병이며, FVIII인자는 내인성 혈액응고반응에 필수적으로 필요한 당단백질이다. 이러한 A형 혈우병 환자는 FVIII의 지속적인 주사에 의해 정상적인 혈액응고반응이 일어나고 생명연장이 가능하다. 본 연구는 인간 혈액응고 제 8인자 단백질영역 중 B-domain을 변형시킨 재조합체(FVIII-dB747)를 유즙으로 분비하는 형질전환 돼지의 후대를 계획적으로 종부시키면서 생산되는 형질전환돼지의 유즙으로부터 FVIII-dB747의 효율적인 정제를 위한 방법을 제공하기 위하여 수행되었다. 분만돈에 옥시토신을 투여하여 FVIII-dB747을 발현하는 유즙을 채취하여 원심분리를 통해 지질과 불순물을 제거하고, 유즙 내 복합적으로 존재하는 수 많은 카제인 단백질을 분획하기 위한 전처리 과정을 실시함으로써 분획의 정도를 확인하였다. 또한 전처리 과정을 통해 분획된 유즙을 이용하여 음이온 교환수지와 친화성 크로마토그래피 방법으로 FVIII-dB747의 정제를 시도하였다. 음이온 교환 크로마토그래피는 인간 혈장 유래의 FVIII을 정제하는데 사용되어지는 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 pH변화에 따른 분리도를 비교하였다. 또한 친화성 크로마토그래피는 B-domain이 결여된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자(BDD rFVIII)을 정제하는데 이용 가능하다고 알려진 단일항체 리간드로 사용한 컬럼을 사용하여 수행하였다. 그 결과, 기존의 ammonium sulfate침전법을 이용한 침전방법보다는 간단하면서 효과적인 전처리 분획방법으로 개선되었으나, pH 변화에 따른 이온교환 수지를 활용한 분리법에서는 카제인 단백질이 FVIII-dB747이 포함된 분획과 함께 유출되는 현상이 발생되었다. FVIII-dB747 형질전환돼지의 유즙을 이온교환 수지로 분리할 경우 전처리과정 중 카제인 단백질을 제거하기 위한 ultra-filteration이 필요한 것을 알 수 있었다.

저자정보

  • 오승호 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 김지윤 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 이원길 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 정학재 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 양병철 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 박미령 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 백선영 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 박진기 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 홍성구 국립축산과학원 동물바이오공학과
  • 오성종 제주대학교
  • 김경운 국립축산과학원 동물바이오공학과

참고문헌

자료제공 : 네이버학술정보

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