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영어

We generated the feasibility of DNA separation in free-solution using genetically engineered repetitive polypeptides as drag-tags. Two different-sized repetitive polypeptides were designed, expressed in E. coli, and purified. They were conjugated to a fluorescently labeled DNA (100 base), and the electrophoretic mobilities of these conjugate molecules were analyzed on a microchip. The results of these studies indicate that genetically engineered repetitive polypeptide is a prominent candidate for rapid and high-throughput genetic mutation detection, such as SNP analysis.

한국어

인간에게 발생되는 여러 질병들 중 많은 부분이 유전자 변형에 기인된 것이고, 이러한 유전자 변형을 빠르고 정확 하게 분석하는 일은 질병의 조기 진단 측면에서 매우 중요 한 일이라 할 수 있다. 인간의 DNA를 분석하는 방법으로는 여러 가지가 있지만, 그 중 모세관 전기영동 장치 (capillary electrophoresis, CE)를 이용하여 염기 서열의 이상 유무를 판별하는 것이 현재 널리 쓰이는 방법 중 하나이다 [1]. CE를 이용하여 DNA를 분석하기 위해서는 먼저 모세관 내부에 점도가 높은 고분자 젤을 충진시킨 후 DNA 샘플을 분석하는데, 이는 일반적으로 DNA의 크기에 따른 분리가 수용액 상에서 불가능하기 때문이다 [2]. 그러나 현재의 이 와 같은 분석 방법은 직경이 좁은 모세관 내부에 고점도의 고분자 젤을 충진시켜야 되는 어려움 때문에 분석 장치를 소형화하는 데에 있어 어려움이 따르며, 특히 길이가 짧은 oligonucleotide의 분리의 경우 분석 한계를 나타내고 있다 [3]. 이러한 문제를 해결하기 위해 DNA 끝에 마찰력을 부여할 수 있는 물질을 연결시킨 후, 수용액 상에서 DNA의 크기에 따른 분리가 가능한 방법이 제안되었다 [4]. 이러한 방법을 End-Labeled Free-Solution Electrophoresis (ELFSE), 또는 Free-Solution Capillary Electrophoresis (FSCE)라 하며 이 때 마찰력을 부여하는 물질을 drag-tag이라 명하였다 [5,6]. Drag-tag으로 사용될 수 있는 물질은 여러 가지가 있지만 효과적인 DNA 분석을 위해서는 수용성 (water solubility), 전기적 중성 (charge neutrality), 균일성 (size monodispersity) 등의 조건을 만족시키는 물질이어야 하며, 반복단위 단백 질은 이러한 조건들을 만족시킬 수 있는 우수한 후보물질로 제안되었다 [7-9]. 일반적으로 생합성을 통해 생산된 자연 계에 존재하는 단백질은 균일한 크기를 갖는다는 장점을 가지고 있으나, 수용성 단백질 대부분은 양전하 또는 음전 하의 전하를 갖는다는 문제점이 있다. 또한 화학적으로 합 성된 고분자 물질의 경우 단량체를 변환시킴으로써 수용성 및 전기적 성질을 조절하는 것이 가능하나 균일한 크기의 고분자 물질을 얻기가 어렵다는 한계가 있다. 하지만 반복 단위 단백질의 경우, 유전자 재조합을 통해 원하는 물성을 갖는 아미노산만으로 구성이 가능하며 DNA 조작에 의하여 반복단위를 늘림으로써 다양한 크기의 단백질을 합성하는 것이 가능하다. 이러한 장점을 바탕으로 수용성이며 전기적 으로 중성인 아미노산들로 이루어진 반복단위 단백질을 합성 함으로써 이상적인 drag-tag에 가까운 물질을 만들 수 있었다. DNA 염기 분석을 하는 방법으로는 크게 DNA polymerase 를 이용하는 방법과 DNA ligase를 이용하는 방법, hybridization 을 이용한 방법 등으로 나뉠 수 있다 [10]. DNA polymerase 를 이용하는 방법 중 single-base extension (SBE) 기술은 ddNTP만을 이용해 DNA primer의 3’ 말단에 오직 하나의 염기만이 덧붙여져 유전자의 이상 유무를 판별하는 방법으 로써 SNP (single nucleotide polymorphism) 등을 밝혀내고 각각의 영향을 규명하는데 효과적으로 사용될 수 있다 [11]. SNP란 유전체 내에서 개개인의 편차를 나타내는 한 개 또는 수십 개의 염기 변이를 말하는 것으로써, 인간의 경우 30억 개의 염기 서열 중 약 0.1% 정도가 개인마다 차이를 보이고 있으며, 이러한 차이가 인종, 피부색, 체질, 질병 등의 유전적 특징을 나타낸다고 알려져 있다. CE를 이용한 DNA 분석은 상대적으로 비싼 운전비용과 복잡하고 비싼 장비를 필요로 하기 때문에 현재는 이러한 CE의 단점을 극복할 수 있으며 소형화, 집적화가 가능한 microchip 상에서의 모세관 전기영동이 활발히 연구되고 있다 [12]. Microchip 시스템의 경우 기존의 CE보다 더 적 은 양의 샘플로 보다 빠른 DNA 분석이 가능하다는 장점 을 가지고 있으나, 장비가 소형화됨에 따라 좁은 모세관 내부를 고점도의 고분자 젤로 충진시켜야 하는 어려움이 발생된다. 또한 SBE 반응 후 전기영동에 의한 분석의 효율 성을 증대시키기 위해서는 모세관 하나 당 여러 개의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 다중 시스템 (multiplexed system) 의 개발이 필요하나 현재의 고분자 젤을 이용한 분석 방법 으로는 길이가 같은 SBE의 생성물들의 분리가 불가능하 다는 한계가 있어 보다 효율적인 분석 시스템을 구현하는데 어려움이 있었다. 따라서 수용액 상에서 DNA 분리를 수 행하는 ELFSE 방법은 이러한 문제점들을 해결할 수 있는 좋은 대안으로 떠오르고 있다. 최근에는 SBE와 ELFSE를 복합적으로 이용하여 DNA 염 기 분석을 시도한 SBE-ELFSE 연구가 보고되었다 [11,13]. 다양한 크기의 drag-tag을 DNA primer에 화학적으로 결 합시킨 후, 결합된 생성물들을 이용하여 SBE 반응을 수행 함으로써 동시에 여러 위치의 염기 분석이 가능하였다. 하 지만 사용된 drag-tag 대부분이 화학적으로 합성한 것이기 때문에 그 합성 길이에 제한이 있어 그에 따른 분석 효율에 도 한계가 있었다. 따라서 본 연구에서는 대장균을 이용하여 반복단위 단 백질을 합성함으로써 보다 큰 크기를 갖는 drag-tag을 생산 하였고 이를 DNA와 연결한 후, 모세관 전기영동을 수행 하였다. 모세관 내부가 수용액으로 충진된 microchip 상에서 서로 다른 크기를 갖는 반복단위 단백질 drag-tag에 동일 한 DNA를 연결시킨 후 전기영동을 통하여 그 이동 속도 의 차이를 살펴봄으로써 효율적인 SBE-ELFSE 시스템의 구현을 위한 기초 실험을 수행하였다.