earticle

영어

Streptomyces scabiei producing phytotoxin called thaxtomin, which cause scab disease on economically important crops such as potato. For molecular genetics study of S. scabiei an effective transformation method was established based on conjugal transfer from Escherichia coli ET12567 (pUZ8002) using a phiC31-derived integration vector, pSET152, containing oriT and attP fragments. The high frequency was obtained on MS medium containing 50 mM MgCl2. In addition, the sequence and location of the chromosomal integration attB site of S. scabiei was identified for the first time in the strains producing thaxtomin by the southern blot analysis of exconjugants and the sequencing of plasmid containing DNA flanking the insertion sites from exconjugant chromosome. Similar to the case of Streptomyces species, a single phiC31 attB site of S. scabiei is present within an ORF encoding a pirin-homolog.

한국어

토양 원핵 미생물인 방선균은 포자를 형성하는 그램 양성 의 박테리아로서 현재 인류의 질병치료에 사용되고 있는 항생물질의 70%를 생산하는 유용한 미생물이다. 그러나 식물에 피해를 주는 경우도 있는데 감자 더덩이병의 원인 물질인 thaxtomin을 생산하는 방선균들 (Streptomyces scabiei, Streptomyces scabies, Streptomyces. acidiscabies, Streptomyces. turgidiscabies)이다 [1,2]. Thaxtomin은 phytotoxin의 일종 으로 감자생산에 심각한 피해를 주는 물질이며 현재까지 밝혀진 10종의 thaxtomin 중 thaxtomin A가 주요한 병원성 요인물질로 밝혀져 있다 [1,2]. 이러한 질병을 구제하기 위해 여러 연구들이 시도되고 있으나 thaxtomin생합성 제어 에 필수적인 분자생물학적인 연구가 방선균의 외부 유전자 에 대한 강력한 제한계, 효율적인 형질전환 시스템의 부재, 재조합체의 불안전성 등으로 인해 많은 어려움을 가지고 있다 [3,4]. 지금까지 방선균의 형질전환에는 주로 protoplast법과 electroporation법 등이 사용되었다. 그러나 이들 방법들은 형질전환율이 높지 않거나 적용되는 방선균이 제한적이라 는 단점이 있다. 최근에 이러한 문제를 극복하기 위하여 Escherichia coli를 공여체로 사용하여 단일가닥 DNA를 세포내로 도입하는 접합전달법 (conjugal transfer)이 도입 되었다 [5,6,7]. 접합전달법은 E. coli 내에서 재조합 플라 스미드의 구축 및 조작이 가능하며 구축되어진 플라스미드 를 방선균으로 직접 전달할 수 있어 유전자 클로닝, 유전자 파괴, 변이유전자 회복 등에 폭 넓게 사용되고 있다. E. coli 를 이용한 접합전달이 Mazodier 등 [8]에 의해 처음으로 보고되어진 이후, 방선균에 존재하는 메틸화된 DNA의 제한 계를 극복하기 위해 DNA의 공여균주 (donor)로 메틸화가 결손된 E. coli ET12567/pUZ8002 [9,10,11]을 사용함으로 써 보다 다양한 속 (genus)의 방선균에 적용할 수 있게 되었 다 [12,13]. 또한 현재 사용되고 있는 접합전달을 위한 벡터들 가운데 방선균의 염색체에 존재하는 attB site로 integration 되는 phiC31유래의 attachment site (attP)와 integrase (int) 기 능을 가진 벡터들이 가장 유용한 것으로 알려져 있다 [5,11]. 이러한 벡터들은 접합전달을 통해 E. coli로부터 방선균으로 전달되고 전달된 벡터의 attP site는 integrase에 의해 방선균 염색체의 attB site로 삽입되게 된다. 그러나 감자 등의 농 작물에 심각한 피해를 주는 thaxtomin생산 방선균에 대한 형질전환방법은 아직 연구된 바 없다. 그러므로 본 연구에서는 thaxtomin을 생산하는 대표적 인 방선균인 S. scabiei의 분자생물학적인 연구를 위해 처 음으로 접합전달법을 이용한 고효율 형질전환법을 구축하 였으며 attP site 삽입 위치인 S. scabiei의 attB site에 대한 특성을 분석하였다.