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영어

B-type natriuretic peptide is a neurohormone secreted in the cardiac ventricles. BNP levels are elevated in patients with ventricular dysfunction. Therefore, the concentration of BNP is important factor to reflect diagnosis and prognosis for cardiovascular disease. In this respect, anti-BNP scFv is an urgent requirement for early diagnosis in the field of biosensor. Herein, the genetic codes of anti-BNP scFv were chemically synthesized and cloned into both pET22b (+) and pColdⅣ vector, respectively. The recombinant scFv was successfully expressed as a functional form in cytoplasm of E. coli and detected through Western blot and ELISA. The highest level of functional expression of anti-BNP scFv was achieved using pET22b (+) vector at 15℃ by addition of 0.1 mM IPTG. Additionally, being exposed to both BNP and ANP, anti-BNP scFv specifically captured only BNP. Therefore, anti-BNP scFv expressed in this study will be applied to measure the concentration of BNP as a diagnostic recognition molecule.

한국어

심장의 심실에서 분비되는 심장혈관 호르몬인 B-type natriuretic peptide (BNP)는 atrial natriuretic peptide (ANP), C-type natriuretic peptide (CNP)와 함께 신경호르몬의 범주에 속하며, 나트륨 조절과 수분 배출의 나트륨뇨배설항진 기능 에 관여하는 중요한 호르몬이다 [1]. pro-BNP의 N-terminal pro-BNP (NT-pro-BNP)와 BNP로의 분절 과정을 거쳐 형성 되는 BNP는 총 32개의 amino acids로 구성되며, cysteine residue에서 disulfide bond로 맞물린 17개의 아미노산 고리 구조에 9개의 amino-terminal tail과 6개의 carboxyl-terminal tail이 각각 연결 되어있는 형태를 띈다 [2]. 혈중 BNP는 심장의 부피팽창과 압력 과부하 등의 심장 이상증상에 반응하여 분비가 촉진 되며, 그 정도가 심할수록 수치가 높게 나타나는 경향을 보인다 [3,4]. 이러한 특성을 이용한 BNP의 혈중 농도 측정은 심장질환의 진단, 예후판정, 그리고 심장병의 치료 경과를 구분 짓는 등 심장기능부전 환자의 진단에 유용하게 이용 되고 있다 [5,6]. 혈청 또는 혈장에서의 BNP 농도 측정은 샌드위치 형태 의 면역학적 검정법을 통해서 효과적으로 측정될 수 있다. 이러한 검정법은 첫 번째 항체를 미립자 위에 고정시켜 항원을 포획하고, 다시 두 번째 항체를 종전의 항원과 반 응 하도록 하는 방법으로, 두 번째 항체에 형광물질 또는 화학발광 표지 그룹을 연결하여 이를 통하여 감지가 가능 하게 된다 [5]. 따라서 BNP 농도 측정에 있어서 BNP를 탐지 할 수 있는 anti-BNP 항체의 이용은 필요 불가결한 요소로 작용한다. 오늘날 항체의 이용에 있어서 크게 각광받고 있는 것으로 대장균과 같은 원핵생물에서 적은 비용으로도 쉽게 발현 및 정제가 손쉬운 single-chain variable fragment (scFv)가 있다. 항체의 heavy chain과 light chain의 variable domain 을 인위적 링커로 연결하여 만드는 scFv는 전체 면역글로 불린 본래의 결합 특이성과 친화성을 유지하면서도 상대적 으로 작은 크기로 인해 보다 선택적이고 강한 상호작용이 가능하며, 균주 기술을 이용한 즉각적인 isolation이 가능 하다는 장점을 가지고 있다 [7]. 또한 그들이 본래 가지고 있던 친화성을 단백질 공학을 통해 한층 증가시킬 수 있는 인위적인 제조도 가능하다는 점 역시 scFv의 큰 특성 중 하나이다 [8]. 이렇게 많은 용이성을 갖춘 scFv는 항체 기술에 있어서 중요한 위치를 차지하게 되었으며 다양한 방법에 걸친 치료 및 진단에의 활용도 또한 높은 실정이 다 [7]. 하지만, 대부분 scFv의 대장균에서의 발현은 불용 성 형태로의 발현율이 높으며, 이러한 형태의 발현은 scFv 의 다양한 이용에 방해 요인으로 작용한다. 따라서 scFv 의 기능적인 가용성 형태로의 발현은 특히 중요한 과제로 남아있다 [9]. 이에 우리는 심장병 진단용 센서의 펩타머로써의 이용을 위한 항 BNP scFv 항체의 대장균 균주 세포질 내에서의 발현을 시도하고자 하였다. 세포질 내의 발현은 periplasmic 발현에서 발생되는 배양액으로의 단백질 손실을 방지하여 높은 농도의 단백질을 회수할 수 있다는 장점이 있다. 본 실 험에서는 대장균에서 재조합 단백질 발현에 가장 널리 쓰이 고 있는 T7 프로모터로 발현시스템을 구축하고 있는 pET 벡터와, 저온 유도성 프로모터인 cspA 프로모터를 발현 시스템으로 구축하고 있는 pCold 벡터를 이용하여 scFv 항체의 세포질 내로의 발현을 시도하였다. 특히 cspA 프 로모터는 낮은 온도에서 전사의 시작과 아미노산 번역이 이루어 지며, 이러한 저온 발현의 특성상 올바른 단백질 접힘이 가능하기 때문에 최근 대장균에서 불용성 단백질 의 가용성 단백질로의 발현에 많이 이용되고 있는 벡터 시스템이다. 본 연구에서는 항 BNP scFv 항체 유전자로 최적 발현 벡터를 탐색하고 단백질 발현에 있어서 온도의 영향, IPTG 투여 농도에 따라 달라지는 발현 양상을 비교하여 최적 발현 조건을 탐색하였으며, 발현된 scFv 항체와 BNP 항원의 친화도를 ANP 항원과의 친화도와 비교하여 항 BNP scFv 항체의 BNP에 대한 특이적 기능성을 확인하였 다. 항 BNP scFv 항체의 대장균 균주에서의 세포질 내 발 현에 관하여 발표 되어진 연구사례가 아직 없으므로, 이번 연구는 최초의 항 BNP scFv 항체 발현 연구가 될 것이라 기대한다. 또한 심장질환의 계속적인 증가 추세로 인하 여 최근, BNP와 같은 심장혈관호르몬 수치를 이용하는 방법에 큰 관심이 집중되고 있는 점을 고려해 볼 때, 항 BNP scFv 항체의 발현은 그 활용에 있어서도 큰 의미가 있다고 하겠다.