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영어

H2AX, a crucial component of chromatin, is implicated in DNA repair, cell cycle check point and tumor suppression. The aim of this study was to identify direct binding partners of H2AX to regulate cellular responses to above mechanisms. Literature reviews and bioinformatical tools were attempted intensively to find binding partners of H2AX, which resulted in identifying two potential proteins, breast cancer-1 (BRCA1) and BRCA1-associated RING domain 1 (BARD1). Although it has been reported in vivo that BRCA1 co-localizes with H2AX at the site of DNA damage, their biochemical mechanism for H2AX were however only known that the complex monoubiquitinates histone monomers, including unphosphorylated H2AX in vitro. Therefore, it is important to know whether the complex directly interacts with H2AX, and also which regions of these are specifically mediated for the interaction. Using in vitro GST pull-down assay, we present here that BRCA1 and BARD1 directly bind to H2AX. Moreover, through combinational approaches of domain analysis, fragment clonings and in vitro binding assay, we revealed molecular details of the BRCA1-H2AX and BARD1-H2AX complex. These data provide the potential evidence that each of the BRCA1 nuclear localization signal (NLS) and BARD1 BRCA1 C-terminal (BRCT) repeat domain is the novel mediator of H2AX recognition.

한국어

세포의 생존과 죽음은 생명 유지에 있어 필수적인 현상 이다. 따라서 불안정한 세포의 과도한 증식이나 또는 세포 의 악영향을 미칠 수 있는 외부 환경요인으로부터 신속하 게 반응하여 세포 내 관련 신호전달 체계를 활성화시켜 결과적으로 비정상적인 세포의 사멸을 유도하거나 세포 내 방어 메커니즘을 활성화 시키게 된다. 이러한 세포의 자기 안정성 유지에 있어 가장 중요한 것은 고유의 유전 정보 안정성 (genomic stability)에 기초한다. 게놈의 불안 정성은 외부의 DNA damage elements (예를 들어, 방사선 이나 자외선 등)에 의해 손상된 DNA에 대한 반응인 DNA damage response (DDR)에 이상이 생겨 발생하게 된다. 여기에는 손상된 DNA부분을 인식하여 수복하는 DNA repair system 또는 불안정한 게놈을 가진 세포의 성장을 억제하는 cell cycle checkpoint의 저하로 인한 염색체의 이상이 증가되는 것들을 포함한다. 좀 더 살펴보면, 진핵 세포에서 DNA double-strands break (DSB)가 발생하게 되면 DNA repair나 damage 존재에 대한 신호전달에 관계 하는 것으로 알려진 여러 인자들이 그 손상된 부분으로 소집하게 되어 하나의 큰 군립을 이루는 nuclear foci의 형태를 가진다(1). 이러한 foci 현상을 만드는 생화학적 기전 은 제일 처음 ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated)의 활성 화와 활성화된 ATM에 의한 손상된 부분에 존재하는 H2A 분자중의 하나인 H2AX에 인산화됨으로써 (γ-H2AX) 시 작된다(2). H2AX의 C-말단 꼬리 (C-terminal tail)에 존재 하는 serine 139가 그러한 인산화에 해당되며, 이러한 변화 는 damage 후 1-3분 안에 매우 빠르게 일어난다. 이러한 인산화된 H2AX의 부분은 시간이 지나면서 다른 여러 단백 질들을 그 부위로 이끌어 foci를 형성하여 관련 DNA 수복 기전 및 cell cycle arrest를 진행하게 되는데, 이는 다시 말해 H2AX의 분자 물질은 세포의 게놈 안정성에 매우 기본적이며 중요한 역할을 한다는 것을 반증한다. 실례로, H2AX를 게놈 상에서 없앤 H2AX-/- 쥐는 염색체 실활, 전좌 또는 이수성 (aneuploidy)의 현상을 가지며(3), DSBs을 유발하는 ionizing radiation (IR)에 노출된 H2AX-/- 세포는 G2 phase와 mitosis로 가는 것을 arrest하지 못하게 된다(4). 최근 몇 년간 H2AX에 관련 연구들의 중심은 IR에 의해 생기는 γ-H2AX foci 현상에 있어, 과연 어느 단백질이 H2AX와 foci에 해당하는 단백질인 Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) complex, Mdc1, 53BP1, BRCA1, Rad51 등을 연결 자로서 역할을 하느냐는 것이었다. 이러한 연구의 중심 실험 은 H2AX에 직접적으로 결합할 수 있는 단백질을 선별하는 것에 있다. 왜냐하면, 최근까지 위의 단백질들은 인산화된 H2AX와 co-localization을 보이는 수준에 머물러 있었다. 이유인 즉은, 세포 안에서 H2AX는 DNA에 둘러싸여 있는 형태로 인한 직접적으로 결합하는 단백체를 찾고 그 기능 을 연구하는 데에 여러 어려움이 있다고 사료되며, 게다가 H2AX의 인산화 잔기인 serine 139를 가인산화 (phosphor mimics) 형태인 glutamic acid로 치환하여 H2AX-/- 쥐 세포에 주입시킨 결과, IR에 의한 nuclear foci 및 DSB hypersensitivity가 복구되지 않았기 때문이다(5). 앞서 언급 한 단백질 중에서 Nbs1, 53BP1, Mdc1이 현재까지 알려진 H2AX에 결합하는 것을 입증하여, 위의 연구 중심을 이루고 있다. 하지만 위의 3가지 단백질로 H2AX에 의한 DDR의 설명을 하기에는 한계가 있다. 본 연구는 DNA 및 게놈 안정성에 관련된 H2AX와 직 접적으로 결합할 수 있는 새로운 단백질을 찾고자 하였다. 먼저 H2AX의 세포 내 기능과 밀접한 연관성을 지닌 단백 질들을 수집하였으며, 이 단백질들을 생물정보학적 기술을 이용하여 기능적으로 H2AX와 가장 중첩되는 기능을 보이 는 단백질들을 판별하였다. 그 다음 판별된 단백질들 중에 이미 H2AX와 결합하는 것으로 보고된 것들을 배제 시키 고, 남은 단백질들을 대상으로 지금까지 발표된 H2AX 논문 을 토대로 결합가능성을 타진할 만한 최종 단백질을 분리하 였다. 이 단백질들이 BRCA1과 BARD1이며, 이들과 H2AX 와의 상호 결합 부위를 추적하였다. 이에 각각의 유전자들 을 확보하고, 클로닝된 유전자를 바탕으로 H2AX와 결합 유무를 판단한 결과, 모두 H2AX와 결합함을 보였다. 게다 가 H2AX의 결합에 작용하는 BRCA1, BARD1의 domain 을 분석하고, 결합 실험을 통하여 상호작용이 가능한 최적 domain 부위를 추적하였다.