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영어

Candida Antarctica lipase A (CalA) has been used because of its suitability in industrial applications. CalA has unique features capable to accept tertiary and sterically hindered alcohols among many hydrolases. CalA gene was cloned and constructed in expression vector such as pColdⅢ/CalA and pPICZαA/CalA. The gene encoding pColdⅢ/CalA was functionally expressed in the cytoplasm of Escherichia coli OrigamiTM B (DE3) cells. The plasmid pPICZαA/CalA linearized by BstXⅠ was integrated into 5'AOX1 region of the chromosomal DNA and was functionally expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Expressed CalA in P. pastoris (0.7 Unit/ml) showed 35 times higher activity than that in E. coli expression system (0.02 Unit/ml).

한국어

Lipase (E.C 3.1.1.3)는 지질 (lipid)을 글리세롤과 지 방산으로 가수분해하는 효소로서 1980년 중반 이래 triacrylglycerol lipase의 단백질공학기술 (protein engineering) 이 발전하면서 세제, 유기합성, 제지산업 등의 산업분야에 응용되었다(1, 2). 일반적으로 가수분해효소는 chiral substrates 를 2차 알코올과 1차 알코올로 분해한다. 반면 Candida antarctica 유래 lipase A 가수분해효소는 불리한 원자의 공간적 배치로 기인한 입체장애에도 불구하고 3차 알코올 로 분해한다고 보고되었다(3). 또한 가수분해 반응의 역반 응인 에스테르화반응에서 lipase A만이 Sn2 위치에서 촉 매 역할을 수행한다. 이러한 lipase A의 기능적 발현을 위해 효율적이고 경제 적인 유전자 재조합 기술 및 발현시스템의 선정은 이 단백 질의 발현양과 활성여부에 큰 영향을 미친다. 현재 재조합 유전자의 발현 및 생산을 위해 주로 쓰이는 숙주는 대장균, 효모, 곰팡이, 동물세포 등이다. 특히 대장균 (Escherichia coli)에서의 외래유전자 발현은 다양하게 개발된 프로모터 (promoter), 값싼 배지, 빠른 생장 속도 등의 이점으로 인해 가장 많이 적용되는 발현시스템 방법이다(4). 그러나 황화물 결합 (disulfide bond) 형성 및 당화 (glycosylation)와 같은 번역 후 수식(posttranslational modification) 과정이 없고, 대장균 내에서 발현된 목적 단백질이 내포체 (inclusion body) 형태로 비활성화되기도 하는 단점을 가지고 있다. 메탄올 자화 효모 (metthylotrophic yeast)인 Pichia pastoris 는 높은 발현율과 분비작용 (secrection)으로 분리가 용이 하다는 장점을 가지고 있어 용해성 (soluble) 단백질의 발현 시스템으로 선호되고 있다. 즉, 외래유전자를 숙주세포 발현 계의 염색체 DNA에 삽입시킬 수 있어 발현계의 안정성 이 높아지고, 고농도 세포배양 시 발생되었던 단백질 발현율 저하를 막을 수 있다. 강력한 메탄올 유동성의 alcohol oxidase 1 (AOX1) 프로모터를 이용함으로써 외래단백질의 대량생산에 유리하다. 또한 진핵세포로서 고등생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하여 스플라이싱 (splicing)을 통한 인트론 (intron)의 제거와 고등동물의 골지체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어, 번역 후 수식 을 통해 활성형 단백질을 생산, 분비할 수 있다(5-7). 최근 P. pastoris에서 Chaetomium thermophilum 유래 glucoamylase(8), Human ScFv against Botulinum Neurotoxin A(9), manganese lipoxygenase (30 mg/L)(10), Aspergillus niger 유래 phytase (65 unit/ml)(11)등의 외래 단백질이 성공적으로 발현되었다. 이에 본 연구는 C. antarctica 유래 의 lipase A (CalA)를 P. pastoris와 E. coli에서 발현을 시도하였고, 각 경우의 발현시스템으로서의 유용성 여부에 대하여 비교분석하였다.