원문정보
Inhibition of Oligomycin Biosynthesis by olmA5 Gene Knock-out in Streptomyces avermitilis
초록
영어
Streptomyces is well known for their ability to synthesize enormous varieties of antibiotics as secondary metabolites. Among them, S. avermitilis produces avermectins, a group of antiparasitic agents used in human and veterinary medicine. However, S. avermitilis also produces oligomycin, which is a potential toxic inhibitor of oxidative phosphorylation in mammalian cells. Therefore, we decided to disrupt oligomycin synthetase gene to prevent co-production of oligomycin in S. avermitilis. To create plasmid for disruption, the smallest gene of oligomycin synthetase gene cluster was obtained by PCR from S. avermitilis chromosome. Then, apramycin resistance gene was inserted in oligomycin synthetase gene for selection. After transformation of this plasmid, oligomycin synthetase gene (olmA5) in the chromosome was displaced with disruption cassette on the plasmid via homologous recombination. As a result of this gene replacement, we obtained mutants (olmA5::apra) that no longer makes the toxic oligomycin. And the mutants confirmed by PCR and HPLC analysis. However, showed no increasement of avermectin production in the mutant was observed.
한국어
Streptomyces avermitilis는 멜라닌 같은 갈색색소 항생 제인 avermectin과 oligomycin 등을 이차대사 산물로 세포 내에 생산한다. 특히 S. avermitilis는 항 기생충 및 항 곤충 의 활성스펙트럼을 갖는 항생제인 avermectin의 유일한 생산 자이다(1). Genome은 linear form으로 9,025,608 bp로 이루어 졌고, GC content는 70.7%이며, 7,574개 이상의 open reading frame (ORF)들이 존재한다고 알려졌다. Oligomycin은 avermectin과 함께 S. avermitilis에서 생산 되는 이차대사산물 중의 하나로서 ATP-synthase와 결합 하여 ATP의 합성을 저해한다. 결국, 미토콘드리아에서 산화 적 인산화반응 (oxidative phoshorylation)을 억제하여 세포를 사멸시키므로 포유동물에 독성물질로 작용하는 반면 에 식물에 자생하는 곰팡이를 사멸하는 진균제로 사용되 기도 한다(2). Huang 등(3)이 Streptomyces sp. MA-5038 (S. avermitilis)에서 처음으로 oligomycin을 분리하였으나, 그 세포독성으로 인해 많은 연구는 이루어지지 않았다. 그러 나 S. avermitilis에서 full genome sequencing이 완료됨에 따라 oligomycin의 생합성에 관여하는 7개의 유전자 (olm) 가 거대한 cluster를 형성하고 있는 것으로 밝혀졌다(4). Oligomycin은 Fig. 1에서와 같이 두 부분의 치환기 차이에 따라 세 종류로 분류되지만 S. avermitilis에서는 oligomycin A와 oligomycin C만이 생성된다. 이와 같이 S. avermitilis 의 야생균주는 avermectin 뿐만 아니라 polyketide 유래의 oligomycin을 생산하기 때문에 avermectin의 산업적 생산 과정에서 oligomycin은 제거되어야만 하는 대사산물이다. 따라서 본 연구에서는 S. avermitilis의 oligomycin 생합성 과정에 관여하는 유전자를 knock-out 시켜 oligomycin의 생합성이 이루어지지 않도록 유도하고, S. avermitilis로부터 유용한 항생물질인 avermectin 만을 생산할 수 있는 균주 개발에 대한 연구를 수행하였다.
목차
서론
실험재료 및 방법
사용 균주 및 플라스미드
시약 및 배양 배지
Chromosomal DNA 및 plasmid의 분리
OlmA5 gene 및 apramycin resistance gene cassette의 PCR
Conjugation에 의한 integration vector의 전달
Mutant (olmA5::apra)의 확인
Oligomycin과 avermetin의 분석
결과 및 고찰
OlmA5 gene의 cloning
Integration vector의 구축 (pKC-olmA5-apra)
Conjugation에 의한 plasmid transfer
Oligomycin gene이 knock-out된 mutants의 선별
Oligomycin과 avermectin 의 분석
요약
감사
REFERENCES