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영어

In this study, the optimization of fabrication conditions was accomplished to make immuno-strip biosensor by the combination of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immuno-chromatographic strip techniques for the detection of Escherichia coli O157：H7. Optimal fabrication conditions of capture antibody concentration, detection antibody concentration, and additive composition of running buffer solution were determined. Optimal concentration was determined as 1.0 mg/mL for both of capture antibody and detection antibody. A composition of 0.5% Tween20 and 3% BSA were selected as optimal additive for buffer solution to prevent non-specific binding.

한국어

오염된 식품 섭취에 따른 식중독 발생이 전 세계적으로 증가하고 있다. 식품 매개성 질병의 일반적 원인으로 병원 성 세균을 들 수 있으며, 그 중에서도 Escherichia coli O157:H7은 식중독을 일으키는 중요한 병원체 중 하나이 다(1). E. coli O157:H7은 육류와 사과주스, 요구르트, 마 요네즈, 우유 등 다양한 식품을 매개로 하며, 물을 통해서 도 감염을 일으킬 수 있고 사람 간의 전이가 가능한 특징 을 갖는다(2). 이 균에 감염되면 용혈성 요독증후군, 출혈 성 대장염과 설사, 신장 부전, 발작 등을 유발하며 심한 경우에는 사망에 이르기도 한다(3). E. coli O157：H7에 의한 식중독 발생 건수는 미국에서만 한 해에 약 73000건에 이르며, 이 중 61 건은 사망으로 연계된 것으로 추정 된다(4). 우리나라에서도 E. coli O157：H7 감염증은 제 1군 전염병으로 지정되어 있으며 지속적으로 발병 사례가 보고되고 있어, 식중독 발생을 사전에 예방하고 원인을 파악하기 위한 신속, 정확한 탐지 시험법의 개발 필요성 은 절대적이다(5). E. coli O157：H7 탐지를 위한 보편적인 분석 방법은 선택배지에서의 배양 및 계수, 형태학적인 동정법과 생화 학적 분리 등이 있다(6). 식품 및 임상 시료와 같은 정의 되지 않은 혼합 시료에서 병원성 세균을 탐지하는 이러한 기본 분석법들은 높은 선택성과 특이성 때문에 오랜 시간 신뢰성 있는 탐지기법으로 사용되어져 왔다(7). 그러나, 이러한 기존 방법들은 전문적 기술을 가진 인력과 결과를 얻기까지 장시간이 소요된다는 단점을 가지고 있다(8). 이와같은 문제점을 해결하기 위해 면역분석법과 헥산을 이용한 분석방법이 개발되었다(9). 헥산을 이용한 미생물 탐지기술은 높은 특이성과 시료의 증폭이 가능한 장점을 가지고 있지만, 세포 추출, 헥산 정제, 증폭과 측정을 포함 한 다단계의 연속적 조작이 요구되는 단점을 가지고 있어 사용 편리성을 가지는 저가의 일회용 바이오센서로 개발 하기 어려운 한계를 가지고 있다. 면역학적 탐지 방법으로 특이적인 항원-항체 반응을 기초로 하여 병원성 미생물을 탐지하는 기술이 대안으로 개발되었으며(10), 이 방법은 헥산을 이용한 탐지기법에서 요구되는 시료 추출과 정제, 증폭의 과정없이 항원에 특이적인 결합력을 가지는 항체 를 멤브레인에 고정화하여 항원과 반응시키는 하나의 조 작만이 필요한 분석단계의 단순화가 가능한 이점을 가지 고 있다. 따라서, 복잡한 시스템이 없이 병원성 세균을 측 정할 수 있는 스트립 형태의 간단한 바이오센서의 개발을 가능하게 만든다. 전형적인 방법으로는 항원 또는 항체와 같은 특정의 분 석대상을 인식하는 분자들을 니트로 셀룰로오스 멤브레인 위에 고정화시킨 형태가 있다. 일반적인 광학 신호 발생의 경우, 발생된 신호는 육안 및 탐지기에 의해 감지 될 수 있으며, 수십분 이내의 분석소요시간을 가진다(11-13). 병 원균 탐지 분야에 면역-크로마토그래피 스트립 형태의 바 이오센서를 적용하기 위해서는, 헥산을 이용한 측정법과 는 달리 시료를 증폭하는 조작이 없기 때문에 탐지 능력 의 향상을 위해 신호 증폭 기술의 도입이 필요하다. 신호 증폭 방법으로는 효소(14), 나노입자(15), 염료 특성을 가 지는 리포솜(16) 등의 다양한 표지물질을 수용체 프로브 에 결합하여 사용하는 방법이 있다. 효소를 이용한 신호증 폭 기술인 효소면역분석법 (ELISA)은 효과적인 증폭 기 술로 면역분석법에 광범위하게 적용되고 있다. 현재 면역-크로마토그래피법에 의해 개발되어 병원성 세균 측정용으로 상용화된 키트가 몇가지 있다. Microfast E. coli O157 (Zeu-Inmunotec, Spain)은 8~18시간 증균 배양한 샘플을 이용하여 5분 이내 결과 확인이 가능하 고(2, 18), VIP for EHEC (Biocontrol system, USA)는 18시간 증균 배양 후 10분 이내의 결과 확인이 가능하 다(2, 19). Reveal for E. coli O157：H7 (Neogen, USA) 은 8~20시간 증균 배양한 샘플을 이용하여 15분 이내에 검출하고, MC Consortium (MC Consortium, USA)은 사전 증균 과정없이, 60분 이내에 검사 완료가 가능하다. 하지만 상용화되어 있는 키트들은 모두 104 CFU/mL의 검출 한계를 가지고 있다(2, 20, 21). 본 연구에서는, E. coli O157：H7 측정을 위한 방법 들 중 ELISA와 면역-크로마토그래피 분석법이 결합된 면역 스트립을 만들기 위한 제작 및 사용 조건을 최적 화하였다. 면역 스트립을 제작하기 위한 핵심 조건으로 포획항체의 농도와 탐지항체의 농도를 선정하여 최적조 건을 결정하였으며, 스트립을 사용할 때 단백질 및 미생 물의 비특이적 결합을 방지하기 위해 시료에 사용되는 첨가제의 최적 조성을 결정하였다. 결정된 최적조건 하 에서 면역 스트립을 제작하고 이를 E. coli O157：H7 검 출에 적용하였다.