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영어

Avermectin (AVM) B1a produced by Streptomyces avermitilis via polyketide pathway is a secondary metabolite with powerful anthelmintic and insecticidal activities, thus being used as an efficient agent in the field of agriculture and animal health. It has been reported that a precursor for AVM B1a biosynthesis was isoleucine and the biosynthetic pathway of AVM B1a was closely similar to that of fatty acid. Based on understanding of the biosynthetic pathway of AVM B1a, we intended to screen various mutants resistant against O-methyl threonine (OMT), an isoleucine-anti metabolite, and/or mutants resistant against p-fluoro phenoxy acetic acid (pFAC), an inhibitor of fatty acid biosynthesis. It was inferred that these mutants could produce
AVM B1a more efficiently, due to the acquired capability of not only overproducing isoleucine intracellularly but also channelling metabolized carbon-sources into the polyketide pathway, thus leading to enhanced biosynthesis of AVM B1a. The resulting mutant (PFA-1 strain) resistant against 100 ppm of pFAC was able to produce approximately 42 fold higher amount of AVM B1a compared to the parallel mother strain (4,200 vs. 100 units/l). In addition, through the process of continuous strain improvement program carried out by gradually increasing the OMT concentration, it was possible to obtain a more attractive mutant with greater AVM B1a production capacity (9,000 units/l). Notable was that significantly higher producer (12,000 units/l) could be selected through further screening of the resistant mutants, this time, to even higher concentration
of pFAC. Meanwhile, through the analysis of AVM B1a production histograms (i.e., number of strains according to their AVM B1a biosynthetic ability) for the earlier strains in comparison with the high producers having the characteristics of resistance to OMT and pFAC, it was found that production stability of the high-yielding producers were remarkably improved, as demonstrated by the fact that larger proportion of the mutated strains had greater capability of AVM B1a biosynthesis (71% in the range between 5,000 and 7,000 units/L; 47% in the range between 6,000 and 7,000 units/l). Based on these consequences, it was concluded that the rational screening strategy based on the understanding of the biosynthetic pathway of AVM B1a was very effective in obtaining high-yielding mutants with the features of enhanced production stability.

한국어

AVM B1a는 Streptomyces avermitilis가 생합성하는 이차대사산물로, 강력한 구충효과를 갖는 polyketide 계열의 물질이다. AVM B1a 생합성의 전구체로 isoleucine이 사용되고 AVM의 생합성 경로가 지방산 합성과 유사하므로, 전구체를 과량생합성하고 polyketide 생합성 경로로 진행되는 탄소원의 흐름이 증가된 변이주를 선별하기 위하여 isoleucine의 아미노산 유사체 (O-methyl threonine)와 지방산합성 저해물질 (p-fluoro phenoxy acetic acid)에 대한 저항성변이주를 선별하고자 하였다. 모균주의 AVM B1a 생산성은 약 100 units/L로 매우 낮은 반면, 100 ppm의 pFAC에 대한 저항성 변이주인 PFA-1는 약 4,200 units/l의 AVM B1a를 생산하는 것으로 관찰되었다. 이 균주를 모균주로 하여 OMT에 대한 저항성을 지속적으로 증가시킬 경우 AVM B1a 생산성이 2배 더 증가한 약 9,000 units/l의 생합성 능력을 보이는 고생산성 변이주를 개발할 수 있었다. 또한 주목할 만하게도 지방산 저해물질인 pFAC에 대한 변이주의 저항성을 지속적으로 증가시킴으로써 AVM B1a 생산성이 11,000 units/L에 이르는 고역가 변이주를 선별할 수 있었다. 한편 상기의 OMT와 pFAC를 이용한 rational screening 전략을 통해 지속적으로 선별한 변이주들에 대한 AVM B1a의 생산성 분포를 histogram을 통해 분석해 본 결과, 초반부에 선별된 돌연변이주들은 AVM B1a의 생합성능력에 있어서 거의 모두가 (95% 이상) 4,000 units/l 이하의 비교적 낮은 범위에 분포하는 반면, OMT와 pFAC의 농도를 높여가며 유도된 저항성 돌연변이주들의 경우에는 이들 중에 고생산성 균주의 비율이 뚜렷하게 증가 (OMT에서 5,000~7,000 unit/l 범위에 71%; pFAC에서 6,000~7,000 unit/L 범위에 47%) 하는 것으로 확인되었다. 이로부터 polyketide 생합성 경로와 AVM B1a의 생합성 경로의 이해를 통해 수행된 rational screening 전략이 AVM B1a 고생산성 뿐만 아니라 고 안정성의 특성을 갖는 균주를 선별하는데 매우 효율적임을 알 수 있었다.