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배경: 발작야간혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)의 유세포분석은 검체의 질에서부터 검사법에 이르기까지 많은 영향을 받지만 PNH 클론의 안정성에 대한 연구는 부족한 실정이다. 그래서 보관시간과 보관온도에 따라 검체의 질이 어떻게 달라지는지 분석하고자 연구를 시행하였다. 방법: 6명의 환자의 말초혈액으로 검사를 시행하였다. 그중 2명은 PNH 환자였다. 모든 검체는 검사실 도착 즉시 검사를 시행하였고 검체를 나누어 하나는 실온(20–25°C)에 보관, 하나는 냉장(4°C)보관을 하고 24, 48, 72시간과 7일 뒤 검사를 시행하였다. 적혈구 분석을 위해 항CD59-FITC (Beckman Coulter, USA), 항CD235a-PE (Beckman Coulter)를 사용하고 호중구를 분석하기 위해 uorescein-labeled proaerolysin (Cedarlane, Canada)과 항CD15-PE (Beckman Coulter), 항CD24-PC5 (Beckman Coulter), 항CD45-PC7 (Beckman Coulter)을 사용하였다. FC500 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하였고 통계학적으로 시간과 온도에 따른 변화를 보기 위하여 일반화추정방정식을 사용하였다. 결과: 분석가능한 적혈구의 비율과 PNH 클론의 크기에 대하여 실온보관군과 냉장보관군을 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이가 없었고, 두 군에서 모두 검체 보관 기간 7일까지도 유의한 차이가 없었다. 분석한 호중구의 비율은 시간이 지남에 따라 감소하였고(P<0.001) 냉장보관한 경우가 처음 검사 시와 더 유사한 값을 보였다(P=0.014). 호중구의 PNH 클론의 크기는 실온 48시간, 냉장 72시간까지 안정하였고 7일째는 분석이 불가능하였다. 결론: 적혈구 분석은 7일까지 검사 가능하였고, 호중구는 시간이 지나면서 분석 가능한 세포의 수가 줄어들기 때문에 48시간 이내에 검사를 시행하는 것을 추천한다.
Background: Flow cytometry analysis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is significantly affected by the methodology used. The lack of data on the effect of age and refrigeration on PNH clone stability motivated us to study these aspects using flow cytometry. Methods: Peripheral blood was collected from six patients, of which two presented with PNH. All samples were tested immediately and stored at room temperature (RT, 20–25˚C) and at 4˚C for re-analysis at 24, 48, 72 hr and 7 days. Anti-CD59-fluorescein isothiocyanate (Beckman Coulter, USA) and anti-CD235a-phycoerythrin (PE; Beckman Coulter) were used to stain red blood cells (RBCs). Fluorescein-labeled proaerolysin (Cedarlane, Canada), anti-CD15-PE (Beckman Coulter), anti-CD24-PE-cyanin 5 (Beckman Coulter), and anti-CD45-PE-cyanin 7 (Beckman Coulter) were used to stain granulocytes. Flow cytometry was performed using a FC500 flow cytometer (Beckman Coulter). The effects of time and temperature were analyzed using generalized estimating equations. Results: No significant differences in the gated percentage of RBCs and PNH clone size of RBCs were observed between the RT and 4˚C groups up to 7 days of testing. The percentage of gated neutrophils decreased with specimen age (P<0.001) and a better correlation with baseline was obtained at 4˚C than at RT (P=0.014). Neutrophil PNH clones were stable until 48 hr and 72 hr at RT and 4˚C, respectively, and could not be analyzed at 7 days. Conclusions: RBC analysis was successfully performed up to 7 days. For neutrophils, testing within 48 hr is recommended, because the number of gated cells decreases significantly with age.
