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목적: 불포합 빌리루빈은 색소성 담석의 주요 성분으로 담즙내의 용해도는 담석 형성에 있어 매우 중요한 인자로 작용한다. 저자는 담즙의 불포합 빌리루빈의 용해 한계와 담즙염 존재하의 동질 분획을 구하여 담즙내 빌리루빈 침전의 병태생리를 알아보고자 하였다. 대상과 방법: 순수 정제한 빌리루빈 결정과 진공증류하에 정제된 CHCl3, 완충액과 담즙염 (taurochlolate:TC, taurodehydrocholate: TDHC)을 시험관에 넣고 회전 혼합기로 혼합한 뒤 원심분리하여 상층을 제거하고(주기 1), 남아있는 하층에 완충액이 첨가된 보조용액을 첨가한 후 2차 분획을 시행 하였다(주기 2). 분획층은 원심분리 직후 pH를 측정 하였으며 빌리루빈의 농도는 Michaelesson diazo 반응을 이용하여 구하였다. 결과: 1. 50 mM TC가 첨가된 완충 수용액에서의 1차 분획과 2차 분획에 따른 불포합 빌리루빈의 농도는 유의한 차이가 없었다. 2. 불포합 빌리루빈의 계산된 분획비율과 역추출에 의해 분석된 분획비율은 일치함을 보였다. 3. pH4.0 와 pH7.0 사이에서는 pH 증가에 따른 불포합 빌리루빈의 용해도는 완만하게 상승하였고 pH7.0 이상에서는 수직비례로 상승하였다. 4. 생리적 pH 상태에서 빌리루빈은 대부분 단가음이온 (monoanion form:HB-) 상태로 존재함을 알 수 있었다. 결론: 완충 수용액의 pH가 높을수록 그리고 담즙염의 농도가 높을수록 불포합 빌리루빈의 용해도가 높았다. pH에 따른 불포합 빌리루빈의 형태는 pH 7.0 이하에서는 이가산 형태(diacid form:H2B0)였고 pH 7.0 이상에서는 이가음이온 형태(dianion form: B=) 이었으나 전 pH에 걸쳐 주종을 이루는 비결합 음이온은 단가음이온(monoanion form:HB-) 였다. 결론적으로, 담즙내의 주된 비결합 음이온은 HB-이며 담석은 Ca(HB)2를 주성분으로 함을 알 수 있다. 담즙염, 레시틴 그리고 칼슘빌리루빈의 용해산물에서 비결합된 HB-, B=의 활동도의 정확한 측정은 아직 알려지지 않았다. 본 연구는 이러한 면에서 음이온의 산물 그리고 담즙에서 포화도는 담즙의 pH 7까지는 증가함을 알았으며 칼슘빌리루빈의 침전을 증가시킴을 알 수 있었다. 향후 빌리루빈의 비결합 산물의 실제 활성도와 칼슘염의 분해산물을 결정 하도록 분획 연구를 확대 해야 한다고 생각된다.색인단어:불포합 빌리루빈, 담석, 담즙산
Background/Aims: Our previous studies of ionization and solubility of unconjugated bilirubin (UCB) yielded inappropriately large differences between the two carboxylic pK'a values of UCB. These data, however, were not ideal due to crystal effects, matastability, impurities of the bilirubin, and imprecision of analyses at low UCB. Methods: The sodium salt of taurocholate (TC) was purified and dissolved in water to 100 mM. Chloroform (CHCl3) was purified by vacuum distillation. Buffers used were: citrate from pH 4 to 6, phosphate from pH 6 to 8, and borate above pH 8. All had an ionic strength of 0.10. The problems were minimized by rapid solvent partition of UCB from CHCl3 into buffered aqueous NaCl, and a new, accurate assay of low UCB in the aqueous phase which was achieved by concentrating the UCB through back extraction into small volumes of CHCl3. Results: In contrast with the crystal dissolution studies, the two pK'a value were similar. H2B0, not HB-, was the dominant UCB species in the pH range of bile (6.0 to 8.0). The aqueous solubilities of UCB were 90 to 98% less. Less than 0.01% of the bile salt partitioned into the CHCl3 phase and self-association of B= was negligible. UCB solubilities in 50 mM TC were 2 to 10% of those obtained by crystal dissolution, and, up to pH 7.9, were below the maximum UCB concentration in normal human bile. Conclusions: We suggest that the markedly increased binding of UCB with each ionization step is due to the disruption of the internal hydrogen bonds of the ionized carboxyl groups on interaction with the bile salt. We propose to extend the study of partition to determine the activity and the degradation products of calcium salts of unbound bilirubin fractions.(Korean J Hepatol 2002;8:80-89)
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Unconjugated bilirubin, Gallstones, Bile salts
